La réaction en chaîne par polymérase représente une procédure de biologie moléculaire qui duplique des sections de matériel génétique (acide désoxyribonucléique, ADN). Des millions de copies identiques sont produites à partir de quantités infimes d'ADN. De cette manière, des quantités sont disponibles qui sont suffisantes pour diverses enquêtes.
Qu'est-ce que la réaction en chaîne par polymérase?
La réaction en chaîne par polymérase représente une méthode de biologie moléculaire qui duplique des sections de matériel génétique (acide désoxyribonucléique, ADN). Le terme réaction en chaîne par polymérase (PCR) décrit la réaction in vitro (en latin: dans le verre) à l'aide d'une enzyme, la polymérase (ADN polymérase), qui conduit à la duplication de certains gène séquences. Le produit de la réaction est également la matière de départ pour un nouveau cycle de cette réaction. Le nombre de molécules double et sert en même temps de modèle pour un nouveau cycle. C'est ce qu'on appelle la multiplication exponentielle. Elle se déroule en laboratoire à une grande vitesse de quelques minutes, semblable à une réaction en chaîne. Ce processus de laboratoire imite la duplication de l'information génétique (ADN) qui se produit dans des conditions naturelles pendant la réplication. Le chimiste américain KB Mullis est considéré comme le découvreur de ce procédé. En 1983, il a introduit ce procédé de synthèse d'ADN et dix ans plus tard, il a reçu le prix Nobel de chimie.
Fonction, effet et objectifs
Dans les organismes vivants, l'ADN chromosomes a une longueur qui ne peut pas être amplifiée par PCR. Au lieu de cela, il est appliqué pour amplifier une section définie. Cela peut être des gènes, une partie spécifique d'un gène, ou des régions qui ne sont pas transcrites en protéines, c'est-à-dire ne sont pas codants. Ces sections ne comprennent généralement pas plus de trois mille paires de bases, contre environ deux fois trois milliards de paires de bases par ensemble de chromosomes chez les humains. La réaction en chaîne par polymérase nécessite une chaîne d'ADN simple ou double brin dont la structure doit être au moins partiellement connue. En plus de l'enzyme, la polymérase, deux amorces sont utilisées. Ce sont des éléments constitutifs de l'ADN qui servent de point de départ et d'arrivée. Ils sont caractérisés par une séquence qui correspond exactement à la région à amplifier. En laboratoire, la réaction en chaîne par polymérase est réalisée dans un bloc chauffant programmable. Les composants nécessaires tels que la polymérase, l'amorce, les éléments de base pour construire le nouveau brin (désoxyribonucléoside triphosphates) et magnésium les ions sont ajoutés ensemble dans une solution tampon. Le programme température-temps de la réaction commence par une dénaturation à une température supérieure à 94 ° C. Dans ce processus, l'ADN double brin est clivé et est présent sous forme simple brin. Dans l'étape suivante, à environ 70 ° C, l'apprêt est lié au gène séquence et constitue le point de départ de la réaction enzymatique. A partir de là, la polymérase synthétise le brin complémentaire. Un nouveau cycle commence alors, composé à nouveau des trois étapes de dénaturation, de liaison d'amorce et de synthèse du brin d'ADN. La réaction en chaîne par polymérase est utilisée en médecine légale, en diagnostic clinique et en recherche clinique. En médecine légale, l'ADN est extrait de peau, salive, de gamme, sperme ou sang à partir de scènes de crime et, après amplification, par rapport à des échantillons connus et utilisés pour identifier des individus spécifiques. En utilisant cette empreinte génétique, la paternité peut également être clarifiée dans une approche modifiée. Dans l'élucidation des maladies, la réaction en chaîne par polymérase est utilisée pour vérifier les gènes impliqués. Certaines maladies bactériennes peuvent être classées en reconnaissant des séquences spécifiques. Les maladies virales peuvent être caractérisées lorsque l'ADN ou l'ARN viral est transformé et amplifié. Dans sang dépistage, il est possible de détecter hépatite ou maladies transmises par le VIH à un stade très précoce. Dans le diagnostic des tumeurs, il est utilisé pour identifier les cellules tumorales. Cela permet de classer la tumeur, d'évaluer l'évolution de la maladie, le succès de la thérapie et le pronostic. En recherche, la réaction en chaîne par polymérase est utilisée pour identifier des gènes associés à diverses maladies.Pour le clonage de gène, qui n'est pas la même chose que le clonage d'un organisme, le gène est amplifié avant d'être transféré à d'autres organismes dans un vecteur (latin: voyageur, porteur ). Ceux-ci peuvent servir de modèles pour mieux étudier la maladie ou pour produire protéines qui peut être utilisé comme médicaments.
Risques et dangers
La réaction en chaîne par polymérase a un énorme potentiel pour détecter des quantités infimes d'ADN. Afin de profiter de la multitude de possibilités et de se prémunir contre des erreurs majeures, certaines conditions préalables et diverses sources d'erreur doivent être prises en compte. Seules les sections du matériel génétique dont la séquence est au moins partiellement connue peuvent être amplifiées. Des séquences totalement inconnues ne peuvent pas être amplifiées par cette méthode. Les produits d'une amplification peuvent être visualisés par la suite. Si le signal attendu n'est pas visible, alors que la séquence recherchée était présente, un résultat faux négatif est présent. Le plus souvent, ceci est le résultat de conditions de réaction non optimisées ou mal optimisées. Celles-ci doivent être déterminées en fonction de la séquence cible. A cet effet, différents profils de température et de temps, séquences et quantités d'amorces ainsi que les concentrations d'autres substances dans le mélange réactionnel sont testés. Les résultats faussement positifs apparaissent comme des signaux qui ne peuvent pas être attribués au produit souhaité. Les problèmes majeurs sont causés par des contaminations avec de l'ADN provenant de l'enquêteur ou d'une source autre que celle à analyser. L'ADN d'origine bactérienne influence également le résultat d'une réaction en chaîne par polymérase. En portant des gants et en prenant grand soin, de telles erreurs peuvent être évitées et des conclusions fiables sur les produits amplifiés peuvent être formulées.
